0

سیستم ویرایش ژن کریسپر

دسته بندی ها : کریسپر, ویرایش ژن ۸ آذر ۱۳۹۸ sajjad 342 بازدید

سیستم ویرایش ژن کریسپر (CRISPR-Cas9)

مقدمه:

سیستم CRISPR/Cas9 به‌عنوان سیستم ایمنی اکتسابی مبتنی بر RNA در باکتری‌ها و آرکی‌ها عمل می‌کند. سیستم CRISPR نوع II که شامل نوکلئاز Cas9 است، از استرپتوکوکوس پیوژنز مشتق شده است. سیستم اصلی CRISPR با درج تکرارهای کوتاه DNA ویروسی در ژنوم باکتری، مقاومت در برابر ویروس‌ها را ایجاد می‌کند. هنگامی‌که یک سلول باکتریایی برای بار دوم آلوده می‌شود، رونویسی از این تکرارها یک نوکلئاز را به سمت DNA مکمل از ویروس مهاجم هدایت می‌کند و بنابراین DNA ویروسی را از بین می‌برد. سیستم CRISPR / Cas9 برای فعال کردن ظرفیت هدف‌یابی ژن در سلول یوکاریوتی حداقل با استفاده از سه مؤلفه زیر می‌تواند در سلول‌های پستانداران شبیه‌سازی شود: Cas9، crRNA (RNA تعیین‌کننده اختصاصیت در کریسپر) و tracrRNA (RNA فعال‌کننده ترانس) کمکی. crRNA و tracrRNA نیز می‌توانند برای تولید یک RNA راهنمای کایمریک (sgRNA) به هم ملحق شوند. ۲۰ نوکلئوتید اول sgRNA مکمل توالی DNA هدف است و به دنبال آن توالی ۳ نوکلئوتیدی به نام PAM (protospacer adjacent motif) قرار دارد.

سیستم‌های ویرایش ژن:

کریسپر تنها سیستم ویرایش ژن نیست، سیستم‌های دیگری که معروف‌ترین آن‌ها ZFNs و TALENs می‌باشند نیز وجود دارند که حتی قبل از کریسپر برای ویرایش ژن استفاده‌شده‌اند ولی مشکل اساسی آن‌ها پیچیدگی طراحی آن‌هاست چراکه بخش شناساگر DNA در آن‌ها پروتئینی است و فرایند طراحی دمین های پروتئینی شناساگر نوکلئوتیدهای DNA، نیازمند محاسبات دقیق و ابزارهای پیچیده بیوانفورماتیکی هست، لذا احساس نیاز به سیستمی مثل کریسپر به وجود آمد و اولین بار در سال ۲۰۱۳ از کریسپر به‌عنوان ابزاری برای ویرایش ژن استفاده شد.

تاریخچه کریسپر:

لوکوس های کریسپر اولین بار در سال ۱۹۸۷ با عنوان Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats که به‌اختصار CRISPR نامیده می‌شود، در ژنوم باکتری‌ها و آرکی‌ها شناسایی شد. در سال ۲۰۰۷ برای اولین بار نقش کریسپر به‌عنوان سیستم دفاعی باکتری‌ها و آرکی‌ها کشف شد و نهایتاً در سال ۲۰۱۳ اولین بار از کریسپر برای ویرایش ژن استفاده شد و تاکنون انواع مختلفی از سیستم‌های کریسپر دارای دقت بالا، جهش‌زایی پایین و بازدهی بالا توسعه‌یافته است.

مکانیسم ویرایش DNA به‌وسیله کریسپر:

بعدازاینکه کریسپر در دو رشته DNA شکاف به وجود آورد، سلول‌های یوکاریوت از دو مکانیسم برای ترمیم این شکاف بهره می‌برند. مکانیسم اول NHEJ یا Non-Homologous End Joining هست در این مکانیسم شکاف در DNA با اتصال دو انتهای غیرهمولوگ در دو طرف آن، ترمیم می‌شود. معمولاً در نقطه اتصال، حذف یا اضافه شدن نوکلئوتیدها اتفاق می‌افتد که موجب تغییر در چهارچوب خواندن و نهایتاً خاموش شدن ژن موردنظر می‌شود. این مکانیسم معمولاً برای Knock out کردن ژن‌ها مورداستفاده قرار میگیرد. مکانیسم دیگر HDR یا Homology Directed Recombination نامیده میشود، تفاوت اصلی این سیستم با سیستم قبلی وجود یک Donor DNA است که دارای بازوی های همولوژی مشابه توالی های دو طرف شکاف، در دو طرف خود میباشد و همین امر باعث فرایند نوترکیبی همولوگ بین آنها و ورود Donor DNA به درون شکاف میشود. از HDR برای آزمایشهای Knock in ژن استفاده میشود.

افزایش دقت کریسپر:

وجود فعالیت خارج از هدف (Off-Target Activity) در کریسپر باعث شده راه حل های بسیاری در چند سال اخیر برای افزایش اختصاصیت آن اتخاذ شود. یکی از این راه حل ها غیر فعال کردن یکی از دمین های نوکلئازی Cas9 و ایجاد Cas9 nickase میباشد که قادر است فقط یکی از رشته های DNA را ببرد، یا غیرفعال کردن هر دو دمین نوکلئازی Cas9 و ایجاد dCas9 یا deadCas9 که هیچ فعالیت نوکلئازی ندارد و با الحاق آن به یک نوکلئاز دیگر به نام Fok1، سیستم Fok1-dCas9 ابداع شد. Cas9 در این سیستم صرفا توانمندی شناسایی ناحیه هدف در ژنوم را دارد و فعالیت نوکلئازی بر عهده Fok1 میباشد( این آنزیم نیز فقط قادر به برش یک رشته از DNA میباشد). در هردو حالت مذکور سیستم کریسپر باید به صورت  جفت یا دوتایی بکار گرفته شود، یعنی لازم است از دو gRNA  یکی برای شناسایی رشته سنس و دیگری برای شناسایی رشته آنتی سنس استفاده شود. تحقیقات نشان داده استفاده از Paired Cas9 nickases (Cas9n) تا ۱۵۰۰ برابر  اختصاصیت کریسپر را افزایش میدهد و استفاده از Dimeric Fok1-dCas9 نیز تا ۱۰ هزار برابر فعالیت موتاژنی کریسپر را کاهش میدهد.

کاربردهای کریسپر:

اولین و مهمترین کاربرد کریسپر، ویرایش ژنوم است که بر مبنای سیستم های ترمیمی NHEJ و HDR برای خاموش کردن یک ژن و تغییر توالی آن استفاده میشود. علاوه بر این از HDR برای درج توالی هایی مثل Tag ها، کاست ژنی و مارکرهای انتخاب در ژن استفاده میشود. کاربرد دیگر کریسپر در Genome regulation میباشد، برای اینکار کافی ست یک مهارکننده یا فعال کننده ژن را به کمپلکس کریسپر الحاق کرد و با طراحی gRNA ی مکمل پروموتر ژن مورد نظر،  بیان ژن را کنترل کرد.

از کریسپر برای Genome reorganization و Genome visualization نیز استفاده میشود. حالت اول معمولا در اپی ژنتیک کاربرد دارد و حالت دوم نیز در نشانه گذاری DNA اهمیت دارد.

sgRNA:

بخش ۲۰ نوکلئوتیدی در sgRNA که مکمل توالی هدف است، شامل توالی Seed و توالی Nonseed است. چندین مطالعه اولیه نشان داده‌اند که ۱۰-۱۲ جفت باز در مجاورت PAM (در انتهای ۳ RNA راهنما)، به نام “توالی Seed“، اختصاصیت Cas9 را تعیین می‌کند و به‌طورکلی از بقیه توالی RNA راهنمای مهم‌تر است.

رویه کلی یک آزمایش کریسپر:

  • انتخاب سکانس هدف برای کریسپر
  • سفارش سنتز gRNA
  • ارسال اجزای کریسپر به درون سلول
  • آنالیز ویرایش ژن

سایت هدف در آزمایشهای ناک اوت در اگزونها، پروموتور و enhancer ژن در نظر گرفته میشود.

هنگام طراحی  gRNA برای ناک اوت کردن ژن، انتخاب سایت های هدف در درون اگزون ها یی که برای عملکرد پروتئین حیاتی هستند، ضروری است. به همین خاطر باید از انتخاب نواحی هدفی که کدکننده آمینواسیدهای بسیار نزدیک به انتهای  N یا  C پروتئین هستند، پرهیز شود. در حالت اولی (انتهایN سلول احتمالا یک کدون آغاز دیگر را در پایین دست پیدا می کند، درحالیکه در مورد حالت دوم (انتهای C) سایت هدف احتمالا یک ناحیه غیرضروری پروتئین را کد می کند.

تعداد حدود ۲ تا ۵  sgRNA با سایت های PAM مختلف، باید برای هر آزمایش ناک این طراحی شود تا شما از ویرایش با بازدهی بالا در آزمایش خود مطمئن شوید. هنگام طراحی sgRNA، جایگاههای برش باید تا حد امکان به محل ناک این نزدیک باشد. شدیدا توصیه می شود که فاصله بین جایگاه برش تا محل ناک این کمتر از ۱۰ جفت باز باشد; بازدهی با افزایش این فاصله سریعا افت می کند.

نتیجه گیری:

استفاده از کریسپر در سال های اخیر به شدت گسترش یافته است. امروزه کریسپر در مهندسی متابولیک و ژن درمانی گسترش یافته ولی این به این معنی نیست که هم اکنون صد در صد  امکان استفاده از آن جهت درمان برخی از بیماریها مثل سرطان وجود داشته باشد، چراکه کریسپر فعالیت موتاژنی دارد و علی رغم تلاش های بسیاری که در چند سال گذشته برای افزایش دقت آن صورت گرفته ولی همچنان مهمترین مانع در استفاده از آن عدم دقت کافی برای استفاده های درمانی است. ولی میتوان گفت کریسپر ابزار بسیاری خوبی برای تولید سویه های میکروبی نوترکیب است.

برای دانلود پکیج جامع آموزش کریسپر اینجا کلیک کنید.

برای دانلود فیلم آموزشی طراحی gRNA اینجا کلیک کنید.

 

 

 

sajjad yazdanpanah
sajjad

راه آسان‌تری برای ارتباط با کاربران‌مان پیدا کرده‌ایم :) عضویت در کانال

مطالب زیر را حتما بخوانید:

  چنانچه دیدگاهی توهین آمیز باشد و متوجه اشخاص مدیر، نویسندگان و سایر کاربران باشد تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاه شما جنبه ی تبلیغاتی داشته باشد تایید نخواهد شد. چنانچه از لینک سایر وبسایت ها و یا وبسایت خود در دیدگاه استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه در دیدگاه خود از شماره تماس، ایمیل و آیدی تلگرام استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاهی بی ارتباط با موضوع آموزش مطرح شود تایید نخواهد شد.  

نظرات کاربران

    پاسخی بگذارید

    نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

    لینک کوتاه :

    عضویت در خبرنامه ویژه مشتریان بیوتیچر

    با عضویت در خبرنامه ویژه بیوتیچر از آخرین جشنواره های سایت باخبر شوید!