0

طراحی gRNA برای کریسپر

دسته بندی ها : کریسپر ۱۱ تیر ۱۳۹۷ sajjad 379 بازدید

طراحی gRNA برای کریسپر:

سیستم کریسپر امروزه در دنیا ابزار مهمی برای ویرایش ژن شده است چراکه مکانیزم راحت و قابل اعتمادی برای این کار دارد. محققان شاید به خوبی با اجزای کریسپر یعنی RNA راهنما و نوکلئاز همراه آن آشنا باشند، اما حقیقت این است که انجام یک پروژه کریسپر کار چندان راحتی نیست. طراحی یک gRNA بهینه، اولین چالشی است که با آن روبه رو میشوید. در این مقاله ما موضوعات زیر را پوشش خواهیم داد.

  1. طراحی gRNA برای هدف آزمایشی شما
  2. اطمینان حاصل کردن از فعالیت on-target در gRNA شما
  3. به حداقل رساندن آثار off-targetهای gRNA شما
  4. بهبود کارکرد ناک اوت کریسپر با استفاده کردن از gRNAهای مختلف
  5. انتخاب بهترین ابزار طراحی کریسپر

طراحی gRNA برای آزمایشهای Knock out:

شاید مهمترین کاربرد کریسپر، knock out یا خاموش کردن یک ژن خاص در ژنوم ارگانیسم برای دست یافتن به عملکرد آن باشد. یک ناک اوت ژنتیکی موفق به طور کلی منجر به از دست رفتن عملکرد پروتئین و اغلب و نه همیشه با یک تغییر در فنوتیپ ظهور می یابد.

رایج ترین راه ساخت کریسپرهایی که در ناک اوت کردن استفاده میشوند، از طریق مسیر ترمیمی اتصال انتهای همولوگ (NHEJ)  میباشد. در این مکانیزم نوکلئاز Cas به کمک gRNA به سمت لوکوس ژنومی صحیح هدایت میشود و دو رشته DNA را برش میزند. در نهایت شکاف ایجاد شده با کمک NHEJ که یک مسیر تعمیری سریع است ترمیم می شود. این مسیر عمدتا باعث اضافه یا حذف شدن یک یا چند نوکلئوتید در شکاف DNA میشود که منجر به جهش تغییر در چهارچوب خواندن و سرانجام خاموشی یا ناک اوت شدن عملکرد ژن مورد نظر میشود.

اساس کار ناک اوت کردن با کریسپر وابسته به جهشهای حذف و اضافه ایست که با مسیر NHEJ در طی ترمیم ایجاد میشود. با این حال جهش های حذف و اضافه کردن، تضمین کننده از دست رفتن عملکرد پروتئین نیستند، مخصوصا وقتی که سایت برشی به درستی انتخاب نشده باشد.

هنگام طراحی gRNA برای ناک اوت کردن ژن، انتخاب سایت های هدف در درون اگزون ها که برای عملکرد پروتئین حیاتی هستند، ضروری است. به همین خاطر باید از انتخاب نواحی هدفی که کدکننده آمینواسیدهای بسیار نزدیک به انتهای N یا C پروتئین هستند، پرهیز شود. در حالت اولی (انتهای N)، سلول احتمالا یک کدون آغاز دیگر را در پایین دست پیدا می کند، درحالیکه در مورد حالت دوم (انتهای C) سایت هدف احتمالا یک ناحیه غیرضروری پروتئین را کد می کند.

پارامترهای بالا برای یک پروژه ناک اوت کردن ضروری است، اما همچنان یک محدوده وسیعی از مکانهای ژنومی را برای طراحی gRNA ، پیشنهاد میدهند. بنابراین برای چنین آزمایشی، محققان میتوانند یکgRNA با اختصاصیت بالا در یک محدوده مکانی خاص، انتخاب کنند. یعنی هرچه محدوده قابل انتخاب وسیع تر باشد شانس انتخاب یک سایت هدف اختصاصی تر بیشتر میشود.

برای دیدن فیلم آموزش طراحی gRNA برای کریسپر اینجا کلیک کنید.

 

طراحی gRNA برای ناک این ها (Knock-ins)

در یک آزمایش ناک این، هدف ویرایش ژنوم مورد نظر با الحاق یک قطعه DNA جدید به درون آن می باشد. در این مورد، محققان تصمیم دارند تا سیستم ترمیمی سلول از مسیر سریع اما کم دقت NHEJ به مسیر پیچیده HDR (ترمیم وابسته به همولوژی) تغییر کند. در HDR، سلول برای پر کردن شکاف دو رشته ای DNA، از روی رشته الگوی  DNAی دهنده کپی برداری میکند. در آزمایشهای KNOCK IN، محققان برای اینکه بتوانند تغییر ژنومی مدنظر خود را ایجاد کنند از یک DNA الگوی اضافه بهره میبرند تا شانس استفاده سلول از آن قطعه برای ترمیم را افزایش دهند.

از انجاییکه آزمایشهای ناک این به یک عنصر اضافی مثل DNA خارجی برای HDR  نیاز دارند، آزادی کمتری در انتخاب سایت های هدف برای طراحی gRNA وجود دارد. مطالعات یک کاهش چشمگیر در کارایی آزمایش ناک این، وقتی که سایت برش در نزدیکی انتهاهای الگوی تعمیر بودند، نشان می دهد. این قضیه باعث محدود شدن پتانسیل gRNAهایی میشوند که میتوانند در اطراف این جایگاه محدود طراحی شوند.  این محدودیت مکانی حتی برای نوکلئاز cas9 که بازها را بدون برش DNA ویرایش میکند، نادر است. بنابراین برای ویرایش ژن، محدودیت مکانی به جای قضیه مکملی سکانس به عنوان یک پارامتر محدود کننده طراحی مطرح می شود.

برای دیدن فیلم آموزش طراحی gRNA برای کریسپر اینجا کلیک کنید.

 

طراحی grna برای CRISPRa و CRISPRi :

پارامترهای حیاتی برای طراحی  gRNA در CRISPRa و CRISPRi نیز متفاوت است. این آزمایشات با هدف قرار دادن پروموتور ژن مورد نظر منجر به فعالسازی یا مهار آن میشوند. موقعیت مکانی gRNA در اینجا محدود است و نیازمند تعادل بین سکانس مکمل و موقعیت بهینه در ضمن طراحی هست.

به طور منطقی، واضح است که یک gRNA بهینه باید به طور اختصاصی به سکانس DNA هدف متصل شود نه هر جای دیگر از ژنوم ( به طور مثال مکمل بودن سکانس و حدود موقعیت هدف، پارامترهای مهمی در اصول طراحی میباشند). اما از بخش های بالا میتوان نتیجه گرفت تصمیم در انتخاب مکملی یا موقعیت به اهداف آزمایش وابسته است.

چگونه میتوان شرایط آزمایشگاهی و ریسک منجر به خطای اساسی در انتخاب gRNA  را آنالیز کرد؟ خبر بد این است که جواب قابل لمس نیست. خبر خوب هم هست. اینکه نقطه قوتی در اعداد وجود دارد. در سال ۲۰۱۶، آقای Doench و همکارانش، اختصاصیت هزاران gRNA را درحال ایجاد کتابخانه ژنومی انسان و موش، آنالیز کردند. با استفاده از ابزارهای بیولوژی محاسباتی، قوانین امتیازبندی برای پیش بینی فعالیت آن-تارگت gRNA ها ابداع شد. قوانین Doench هم اکنون در بسیاری از ابزارهای آنلاین طراحی gRNA مورد استفاده قرار میگیرد.

برای دانلود پکیج کامل آموزش کریسپر اینجا کلیک کنید.

برای دانلود فیلم آموزشی ناک این ژن با کریسپر اینجا کلیک کنید.

sajjad yazdanpanah
sajjad

راه آسان‌تری برای ارتباط با کاربران‌مان پیدا کرده‌ایم :) عضویت در کانال

مطالب زیر را حتما بخوانید:

  چنانچه دیدگاهی توهین آمیز باشد و متوجه اشخاص مدیر، نویسندگان و سایر کاربران باشد تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاه شما جنبه ی تبلیغاتی داشته باشد تایید نخواهد شد. چنانچه از لینک سایر وبسایت ها و یا وبسایت خود در دیدگاه استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه در دیدگاه خود از شماره تماس، ایمیل و آیدی تلگرام استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاهی بی ارتباط با موضوع آموزش مطرح شود تایید نخواهد شد.  

نظرات کاربران

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

لینک کوتاه :

عضویت در خبرنامه ویژه مشتریان بیوتیچر

با عضویت در خبرنامه ویژه بیوتیچر از آخرین جشنواره های سایت باخبر شوید!