0

ناک این ژن با کریسپر(Knock-in CRISPR)

دسته بندی ها : کریسپر, ویرایش ژن ۲۰ تیر ۱۳۹۸ sajjad 229 بازدید

مقدمه:

CRISPR-Cas9 ابزاری قدرتمند است که از آن برای ویرایش مؤثر ژنوم های سلول‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی استفاده می‌شود. این سیستم با ایجاد شکاف در ۲ رشته DNA باعث آغاز مکانیسم تعمیر ذاتی در سلول می‌شود که نهایتاً منجر ویرایش ژنوم می‌شود. این شکاف امکان فعال شدن ۲ نوع مسیر ترمیمی را فراهم می‌کند. ترمیم اتصال انتهای غیرهمولوگ (non-homologous end joining (NHEJ) repair) و ترمیم وابسته به همولوژی(homology-directed) یا (HDR). ترمیم NHEJ شکاف را با اتصال ۲ انتهای DNA به هم ترمیم می‌کند، این فرایند اغلب با اضافه یا حذف کردن نوکلئوتیدها صورت می‌پذیرد. ازآنجاکه این حذف و اضافه کردن‌ها منجر به تغییر قالب خواندن می‌شود، از این مسیر می‌توان برای غیرفعال کردن ژن‌ها استفاده کرد. (ناک اوت کردن).

در عوض اگر از یک DNA دهنده خارجی استفاده شود، مسیر HDR رقم می‌خورد. این مکانیسم از DNA همولوگ برای ترمیم شکاف  DNA استفاده می‌کند بنابراین بسیار دقیق است. از HDR می‌توان برای جایگزینی نوکلئوتیدی خاص یا اضافه کردن سکانس مطلوب به DNA ژنومی بهره برد. (ناک این کردن)

ناک این ژن با کریسپر(مراحل طراحی آزمایش ناک این):

      ۱. شناسایی و توالی یابی ناحیه هدف:

ناحیه ای که قرار است نوکلئوتید یا سکانس مورد نظر را در آن ناک این کنید، شناسایی کنید. از آنجاییکه لاین های سلولی در گذر متحمل جهش هایی میشوند، سکانس سلولهای هدف شما ممکن است با سکانسی از آنها که در دیتابیس های ژنوم عمومی وجود دارد، فرق کند. بنابراین ما توصیه می کنیم با روش سنجر(۱kb) توالی ناحیه مورد نظر را سکانس کنید تا بتوانید یک DNA دهنده با همولوژی تایید شده، طراحی کنید.

      ۲. طراحی RNAهای راهنما:

ما توصیه می کنیم که از RNA راهنمای منفرد سنتتیک اصلاح شده به روش شیمیای(sgRNA) برای ناک این مورد نظر استفاده کنید. اصلاح شیمیایی اختصاصی سایت در این راهنماها به تجزیه اگزونوکلئازی مقاوم است و لذا باعث افزایش بازذهی ویرایش می شود.

تعداد حدود ۳ تا ۵ sgRNA با سایت های PAM مختلف، باید برای هر آزمایش   HDR طراحی شود تا شما از ویرایش با بازدهی بالا در آزمایش خود مطمئن شوید. هنگام طراحی sgRNAها، جایگاههای برش یاید تا حد امکان به محل ناک این نزدیک باشد. شدیدا توصیه می شود که فاصله بین جایگاه برش تا محل ناک این کمتر از ۱۰ جفت باز باشد; بازدهی با افزایش این فاصله سریعا افت می کند.

بعضی اوقات ناک این تنها در یک آلل  (برای مثال در ویراش مونوآللی)، برای تکرار یک فنوتیب یا حالت بیماری مطلوب است. برای افزایش فرکانس ویرایش مونوآللی نسبت ویرایشهای دوآللی، فاصله بین جایگاه برش تا محل ناک این را میتوان تا ۲۰ جفت باز افزایش داد یا یک مخلوطی از الگوها شامل توالی مطلوب یا فقط توالی شامل یک موتاسیون، در آن فاصله وارد شود.

برای دانلود فیلم آموزشی طراحی gRNA اینجا کلیک کنید.

برای دانلود فیلم آموزشی ناک این ژن با کریسپر اینجا کلیک کنید.

      ۳. طراحی DNA دهنده:

۳ الگوی DNA دهنده وجود دارد: پلازمید/DNA دورشته ای، DNA تک رشته ای و ویروس مجتمع آدنو. هر الگو متشکل از توالی ژنتیکی مطلوب که در کنار۲ ناحیه همولوگ(بازوهای همولوژی) قرار دارند. بر اساس نوع الگو و طراحی آزمایش، دیگر عناصر ژنتیکی نیز ممکن استفاده شوند. نوع الگویی که انتخاب می کنید به مقدار زیاد بستگی به سایز اینسرت ناک این دارد.

  • پلازمید/DNA دو رشته(dsDNA)

پلازمیدها ( متشکل از DNA دورشته ای) به راحتی در آزمایشگاه تولید میشوند و مناسب برای توالی های الحاقی بلند (بزرگتر از ۵۰ جفت باز) هستند. برای مثال اگر کسی بخواهد یک ژن گزارشگر مثل GFP را الحاق کند یا به جای توالی ژن کاملی قرار دهند، یک پلازمید ممکن است بهترین گزینه باشد. برای ساخت یک الگو، توالی ژنتیکی مطلوب باید در پلازمید کلون شود. راه حل دیگر این است که DNA دو رشته ای با  PCRتولید شود.

برای پلازمید/DNA دورشته ای، استفاده از بازوهای همولوژی بین ۵۰ تا ۸۰۰ جفت باز پیشنهاد می شود. به طور کلی، افزایش طول بازوهای همولوژی احتمال رخ دادن HDR را افزایش می دهد. کیفیت بالای  DNA برای ممانعت از سمی شدن سلول ضروری است.

  • DNA تک رشته ای(ssDNA)

الگوهای DNA تک رشته ای (که الیگودئوکسی نوکلئوتیدهای تک رشته ای نیز نامیده می شوند.) برای اصلاحات کوچک با طول کمتر از ۵۰ جفت باز مفید هستند. برای الحاق های کوتاه، طول بین ۵۰ تا ۸۰ جفت باز برای بازوهای همولوژی معمول می باشد. برای تغییر تنها یک نوکلئوتید، ما طول ۵۰ جفت باز را برای هر بازوی همولوژی توصیه می کنیم. الگوهای DNA تک رشته ای تا طول ۲۰۰۰ جفت باز (نوع تجاری) وجود دارند یا میتوان با استفاده از کیت آنها را تولید کرد. کیفیت بالای  DNA برای ممانعت از سمی شدن سلول ضروری است.

شواهدی حاکی از ان است که ناک این یک نوکلئوتید منفرد با استفاده از DNA تک رشته ای می تواند از مسیری به نام تعمیر الگو تک رشته ای (SSTR) که برپایه نوترکیبی همولوگ نیست پیش برود.

  • ویروس مجتمع آدنو(AAV)

ویروس مجتمع آدنو ویروسهای دارای DNA تک رشته ای غیر پاتوژن هستند. AAVهای نوترکیب با حذف ژنهای بیماریزا و الحاق توالی مطلوب در مجاورت تکرارهای ترمینال معکوس(ITRs) ساخته می شوند.

AAVهای نوترکیب به طور طبیعی این توانایی را دارند که نوترکیب همولوگ را شبیه سازی کنند و بنابراین به عنوان الگوهای دهنده بسیار کارامد هستند. وقتی به کمک RNPs ارسال میشوند، بازدهی بسیاری برای ناک این از خود نشان دادند.

سروتایپهای مختلفی از AAV برای بافت‌های مختلف استفاده می‌شود. برای مثال AAV6 نتایج ناک این بسیار کارآمدی در سلول‌های T نخستین، سلول‌های CD34، سلول‌های بنیادی خون‌ساز از خود نشان داده است. موانعی چون قیمت نسبتاً بالا، زمان طولانی برای تولید و محدودیت برای قطعات بالاتر از ۴۵۰۰ جفت باز از موانع استفاده از وکتورهای AAV هست.

برای دانلود پکیج کامل آموزش کریسپر اینجا کلیک کنید.

sajjad yazdanpanah
sajjad

راه آسان‌تری برای ارتباط با کاربران‌مان پیدا کرده‌ایم :) عضویت در کانال

مطالب زیر را حتما بخوانید:

  چنانچه دیدگاهی توهین آمیز باشد و متوجه اشخاص مدیر، نویسندگان و سایر کاربران باشد تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاه شما جنبه ی تبلیغاتی داشته باشد تایید نخواهد شد. چنانچه از لینک سایر وبسایت ها و یا وبسایت خود در دیدگاه استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه در دیدگاه خود از شماره تماس، ایمیل و آیدی تلگرام استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاهی بی ارتباط با موضوع آموزش مطرح شود تایید نخواهد شد.  

نظرات کاربران

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

لینک کوتاه :

عضویت در خبرنامه ویژه مشتریان بیوتیچر

با عضویت در خبرنامه ویژه بیوتیچر از آخرین جشنواره های سایت باخبر شوید!