0

تأثیر off-targetها بر مهندسی ژنوم با واسطه کریسپر

دسته بندی ها : کریسپر, ویرایش ژن ۲۶ مهر ۱۳۹۸ sajjad 20 بازدید

تأثیر off-targetها بر مهندسی ژنوم با واسطه کریسپر:

CRISPR / Cas9 یک فناوری ویرایش ژنوم همه‌کاره است که به‌طور گسترده برای مطالعه عملکرد عناصر ژنتیکی و همچنین برای ایجاد ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی و همچنین تحقیقات بالینی در اختلالات ژنتیکی مورداستفاده قرار می‌گیرد. بااین‌حال ، فرکانس بالای فعالیت خارج از هدف (۵۰ ≥) – جهش ناشی از  RNA-endonucleaseدر سایت‌های غیر از سایت موردنظر – یکی از نگرانی‌های مهم به‌ویژه برای کاربردهای درمانی و بالینی است. در اینجا ، ما سازوکارهای اساسی زمینه‌ساز برش خارج از هدف به‌وسیله سیستم CRISPR / Cas9، روش‌های تشخیص جهش‌های غیر هدف (off-target) و استراتژی‌هایی برای به حداقل رساندن شکاف‌های ناشی از off-targetها را مرور می‌کنیم. افزایش اختصاصیت off-targetها در سیستم CRISPR / Cas9 همبستگی محکمی بین ژنوتیپ و فنوتیپ و درنتیجه تفسیری مطمئن از داده‌های ویرایش ژنوم فراهم می‌کند، که مطمئناً کاربرد اساسی و بالینی این فناوری را تسهیل می‌کند.

سیستم CRISPR (خوشه‌ای ، منظم بافاصله ، تکرارهای پالیندروم کوتاه) / Cas9 ، که در گونه‌های متنوع باکتریایی و آرکی‌ها موجود است ، با موفقیت برای ویرایش ژنوم یوکاریوتی مورداستفاده قرارگرفته است. این فنّاوری هم‌اکنون درزمینهٔ های متنوعی مانند مدل‌سازی بیماری‌های حیوانی ، علم مواد ، فناوری گیاهی اصلاح‌شده ژنتیکی ، فناوری سوخت‌های زیستی ، ژن‌درمانی و توسعه دارو امیدبخش است. علاوه بر این ، فناوری CRISPR / Cas9 به میزان قابل‌توجهی درک سازمانی و عملکردی از ژنوم، در سطح سیستم‌ها را تسریع کرده و از این طریق به ایجاد پیوندهای منطقی و محکم بین تغییرات ژنتیکی و فنوتیپهای بیولوژیکی کمک می‌کند. بااین‌حال ، جهش‌های خارج از هدف (off-target mutations) که در فرکانس‌های بالاتر از جهش‌های موردنظر اتفاق می‌افتند ممکن است باعث بی‌ثباتی ژنومی‌شوند و عملکرد دیگر ژن‌های طبیعی را مختل کنند، هنوز هم یکی از نگرانی‌های مهم هنگام استفاده از سیستم CRISPR / Cas9 به کاربردهای پزشکی و بالینی است.

مکانیسم اثرات off-targetها در سیستم Crispr / Cas9:

سیستم CRISPR / Cas9 به‌عنوان سیستم ایمنی تطبیقی مبتنی بر RNA در باکتری‌ها و آرکی‌ها عمل می‌کند. سیستم CRISPR نوع II ، که شامل نوکلئاز ۹ مرتبط با CRISPR (Cas9) است ، از استرپتوکوک پیوژنز مشتق شده است. سیستم بومی CRISPR با درج تکرارهای کوتاه DNA ویروسی در ژنوم باکتری ، مقاومت در برابر ویروس‌ها را ایجاد می‌کند. هنگامی‌که یک کلنی باکتریایی برای بار دوم آلوده می‌شود، رونویسی از این تکرارها یک نوکلئاز را به سمت DNA مکمل از ویروس مهاجم هدایت می‌کند و بنابراین DNA ویروسی را از بین می‌برد. سیستم CRISPR / Cas9 برای فعال کردن ظرفیت هدف‌یابی ژن در سلول یوکاریوتی حداقل با استفاده از سه مؤلفه زیر می‌تواند در سلول‌های پستانداران بازسازی شود: Cas9، crRNA (RNA  تعیین‌کننده اختصاصیت در کریسپر) و tracrRNA (RNA فعال‌کننده ترانس) کمکی. crRNA و tracrRNA نیز می‌توانند برای تولید یک RNA راهنمای کایمریک (sgRNA) به هم ملحق شوند. ۲۰ نوکلئوتید اول sgRNA مکمل توالی DNA هدف است و به دنبال آن توالی ۳ نوکلئوتیدی به نام PAM یا  protospacer adjacent motif قرار دارد.

اگرچه اعتقاد بر این است که اختصاصیت هدف‌یابی Cas9 توسط سکانس راهنمای ۲۰ نوکلئوتیدی در sgRNA  و حضور یک PAM در مجاورت توالی هدف در ژنوم کنترل می‌شود، اما فعالیت آف تارگتی هنوز هم می‌تواند در توالی DNA حتی  با سه تا پنج mismatch در قسمت PAM-distal از سکانس راهنما در sgRNA رخ دهد. علاوه بر این ، مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ساختارهای مختلف RNA راهنما می‌توانند بر شکاف سایت‌های حاصل از آف تارگت ها و آن تارگت ها (on-target) تأثیر بگذارند. مطالعات ساختار کریستال و آزمایش‌ها روی DNA تک‌مولکولی نشان می‌دهد درحالی‌که سایت PAM برای شروع اتصال Cas9 ضروری است، توالی seed معادل انتهای ۳  از توالی تشخیصی crRNA، به‌طور مستقیم در مجاورت PAM ، همچنین برای اتصال بعدی Cas9 ، تشکیل حلقه R و فعال‌سازی فعالیت‌های Cas9 در هسته مهم است.

sgRNA:

sgRNA شامل توالی seed و توالی غیر seed است (تصویر۱). چندین مطالعه اولیه نشان داده‌اند که ۱۰-۱۲ جفت باز در مجاورت PAM (در انتهای ۳ RNA  راهنما) ، به نام “توالی seed” ، اختصاصیت Cas9 را تعیین می‌کند و به‌طورکلی از بقیه توالی RNA راهنمای مهم‌تر است.

توالی seed بر اختصاصیت اتصال Cas9-sgRNA از طریق مکانیسم‌های بالقوه متعدد تأثیر می‌گذارد. توالی ناحیه seed فراوانی بخش”seed + NGG” را در ژنوم تعیین می‌کند و غلظت مؤثر کمپلکس Cas9-sgRNA را کنترل می‌کند. در همین حال، seed های غنی از U منجر به کاهش فراوانی sgRNA و افزایش اختصاصیت آن می‌شوند زیرا چندین توالی U در سکانس می‌توانند خاتمه رونویسی sgRNA را القا کنند. به‌طورکلی ، mismatch در یک تا پنج جفت باز در انتهای ‘۵ sgRNAها نسبت به موارد موجود در انتهای ‘۳ بهتر تحمل می‌شود. عدم تطابق تک و دوتایی بسته به موقعیت آن‌ها در طول هیبرید RNA-DNA ، با درجات مختلفی تحمل می‌شود. همچنین گزارش‌شده است که sgRNA با محتوای GC خیلی کم یا خیلی زیاد، تمایل به فعالیت کمتری دارد. در مطالعه‌ای از جهش‌زایی باواسطه CRISPR / Cas9 در دروزوفیلا ، رن و همکارانش همبستگی مثبتی بین بازده جهش‌زایی و محتوای GC در نزدیکی‌ترین منطقه به توالی PAM از sgRNA ها مشاهده کردند. بر اساس شواهد آن‌ها sgRNA هایی که دارای حداقل چهار GC در سکانس شش جفت بازی در مجاورت توالی PAM هستند، دارای جهش ارثی هستند (یعنی جهش ایجادشده توسط sgRNA از سیستم CRISPR / Cas9 در والدین قادر است به نسل بعدی منتقل شود). نرخ بیش از ۶۰٪ ، نشان می‌دهد که این sgRNAها می‌توانند با توجه به محتوای GC نزدیک به توالی PAM انتخاب شوند. هنگام انتخاب توالی sgRNA مناسب، گوانین به‌عنوان اولین باز توالی seed که بلافاصله در مجاورت PAM می‌گیرد، به‌شدت ترجیح داده می‌شود و سیتوزین به‌شدت نامطلوب است. برعکس ، ترجیح برای سیتوزین، اما نه گوانین، در باز موقعیت شماره ۵ یعنی باز پنجم نزدیک به PAM وجود دارد. آدنین در وسط sgRNA مطلوب است و سیتوزین در موقعیت ۱۸ نامطلوب است. این اصول طراحی احتمالاً براساس این نظریه استوار است که توالی‌های غنی از گوانین می‌توانند در داخل بدن به شکل ساختارهای غیرکانونی پایدار به نام G-quadruplexes in vivo قرار بگیرند ، که به پایداری sgRNA کمک می‌کند. بااین‌حال ، این ترجیح کدونی تا حد زیادی به سایت هدف بستگی دارد و توالی دم tracrRNA برای فعالیت Cas9 در داخل بدن نیز بسیار حیاتی است.

Pam:

توالی PAM نیز بر فعالیت sgRNA تأثیر می‌گذارد. نتایج اولیه نشان داد که NGG (N  می‌تواندA،T ، C یا G باشد) توالی متعارف برای PAM است. بااین‌حال ، مطالعات اخیر نشان داده‌اند که سیستم CRISPR نوع II می‌تواند از NRG نیز استفاده کند (R می‌تواند A یا G باشد)، البته تنها با یک‌پنجم از راندمان اتصال در مقایسه با NGG. فرکانس اتصال هر باز در توالی PAM متفاوت است. نوکلئوتید اول PAM باوجود باز G در تقریباً ۵۰٪ از سایت‌های اتصال ، در کمترین میزان حفظ‌شده است ، درحالی‌که موقعیت دوم باوجود باز G در بیش از ۹۰٪ سایت‌های اتصال نشان می‌دهد که NRG  برای طراحی توالی CRISPR / Cas9 بهینه نیست. بنابراین ، تأثیر دقیق توالی NRG بر برش توسط DNA Cas9 تا حد زیادی ناشناخته است.

هنگامی‌که sgRNA های مربوط به DNA هدف از طریق ابزارهای معمول طراحی CRISPR / Cas9 طراحی می‌شوند، هر sgRNA دارای PAM خاص خود که معمولاً NGG می‌باشد. بااین‌حال در عمل، اگر بخواهیم به الحاق دقیق یا جهش نقطه دقیق در ژنوم برسیم، ممکن است جایگزین مناسبی برای NGG در sgRNA وجود نداشته باشد، بنابراین توالی NRG  می‌تواند  به‌عنوان یک جایگزین، هرچند با بازده کم تلقی شود. در مواردی که NGG و NRG قادر به ارائه یک طراحی بهینه از sgRNA ها نیستند ، ممکن است یکی دیگر از سیستم‌های CRISPR / Cas9 را انتخاب کنید (ارتولوگ های Cas9  شامل: Streptococcus thermophilus Cas9 و Staphylococcus aureus Cas9). در هنگام استفاده از این ارتولوگهای Cas9 برای ویرایش ژن، NGA ، NAC (شکل ۲) می‌توانند بدون ایجاد اثرات آف-تارگتی بیشتر در مقایسه با نوع وحشی SpCas9 مورداستفاده قرار گیرند.

پروتئین Cas9 و دیگر فاکتورها:

انتقال مستقیم پروتئین Cas9 خالص‌شده و sgRNA به سلول منجر به کاهش اثرات آف-تارگتی در مقایسه با انتقال پلاسمیدهایی که دارای توالی Cas9 و sgRNA هستند، می‌شود زیرا کمپلکس‌های ریبونوکلئوپروتئین Cas9-sgRNA، DNA کروموزومی را تقریباً بلافاصله پس از ورود شکاف می‌دهند و خود به‌سرعت تخریب می‌شوند.

اثرات آف-تارگتی ممکن است خاص نوع سلول و وابسته به به‌کارگیری مسیرهای ترمیم  شکاف دو رشته (DSBs) نوع خاص سلول باشد. به‌عنوان‌مثال ، اثرات آف-تارگتی نوکلئاز می‌تواند در رده‌های سلولی ترانسفرم شده انسان با مسیرهای ترمیمیDSBs  نامنظم رخ دهد، درحالی‌که توالی یابی کل ژنوم کلون‌های سلول‌های بنیادی پرتوان انسان با قابلیت ترمیم DSBs نسبتاً سالم، تعداد کمی جهش آف-تارگت را نشان می‌دهد. علاوه بر این، متیلاسیون DNA در سایت‌های CpG ممکن است مانع از کارآیی اتصال Cas9 در سلول‌ها و مولکول‌های کوچک دخیل در فرایندهای ترمیمی HDR و NHEJ شود.

به‌طور خلاصه ، توالی seed و PAM ، که اجزای ضروری CRISPR / Cas9 هستند ، باید با دقت طراحی شوند. علاوه بر این ، استفاده از پروتئین Cas9 خالص و همچنین مولکول‌های تعدیل‌کننده مسیرهای DSBs، که هم بر کارایی on-target و off-target تأثیر می‌گذارد ، باید در کاربردهای فردی در نظر گرفته شود.

روش‌های شناسایی Off-target:

شناسایی سایت‌های Off-target به روشی بسیار حساس و جامع همچنان یک چالش اساسی درزمینهٔ ویرایش ژن‌ها است. روش سنجش اندونوکلئازI T7  که در ابتدا برای شناسایی جهش‌های Off-target مورداستفاده قرار گرفت، حساسیت پایینی دارد (نمی‌تواند جهش‌های آف-تارگتی که در فرکانس‌ها <1٪ رخ می‌دهد را تشخیص دهد) و برای غربالگری در مقیاس بزرگ نه عملی و نه مقرون‌به‌صرفه است. روش‌های پیشرفته مختلفی برای شناسایی آف-تارگتها ازجمله توالی یابی عمیق (اندازه‌گیری جهش در فرکانس‌های مختلف از ۰.۰۱ تا ۰.۱٪)، ابزارهای پیش‌بینی مبتنی بر وب و ChIP-seq اخیراً توسعه‌یافته و به‌طور گسترده سازگار شده است(جدول۱).

الگوریتم‌های مبتنی بر وب محدودیت ذاتی دارند زیرا این ابزارها فرض می‌کنند که توالی‌های آف-تارگت در نزدیکی سایت هدف قرار دارند، بنابراین ممکن است آف-تارگتهای دورتر از سایت هدف که شباهت کمتری با توالی هدف دارند را از دست بدهد. ChIP-seq برای شناسایی سایت‌های آف-تارگت برای sgRNA های کمپلکس شده با Cas9 کاتالیزوری غیرفعال (dCas9) استفاده می‌شود. خوشبختانه اکثر آثار منتشرشده نشان می‌دهد که در تعداد کمی از موارد ، در صورت وجود ، آف-تارگتها توسط نوکلئاز فعال Cas9 ایجادشده است.

شناسایی ژنومی گسترده و غیرمستقیم از DSB های فعال‌شده توسط توالی (GUIDE-seq) که توسط اندونوکلئازهای هدایت شده با RNA (RGEN) معرفی شده است، قادر به پروفایل دهی ژنومی گسترده از برش آف-تارگتها توسط CRISPR است. GUIDE-seq شامل یک فرایند دو مرحله ای است. اول، DSB های ناشی از RGEN در ژنوم سلول‌های زنده انسانی با ادغام یک الیگودوکسی نوکلئوتید دو رشته ای ۳۴ جفت بازی با انتهای صاف از طریق فرآیند NHEJ برچسب گذاری می‌شوند. دوم، سایت‌های ادغام dsODN در DNA ژنومی دقیقاً در سطح نوکلئوتید با استفاده از ازدیاد بی طرفانه و توالی یابی next-generation ترسیم می‌شوند.

استراتژی هایی برای به حداقل رساندن اثرات آف-تارگت مختلف:

استراتژی های مختلفی برای کاهش اثرات آف-تارگتی RGEN (اندونوکلئازهای هدایت شده با RNA) گزارش شده است. اولا توالی sgRNA قابل تغییر است. کوتاه کردن انتهای ۳ sgRNA (برگرفته از دمین tracrRNA که با Cas9 در تعامل است)، کوتاه کردن ناحیه مکمل سایت هدف در انتهای ۵ sgRNA به اندازه ۳ نوکلئوتید (tru-gRNA) یا افزودن دو نوکلئوتید گوانین به انتهای ۵ sgRNA (دقیقاً قبل از منطقه مکمل ۲۰ نوکلئوتیدی) اختصاصیت قسمت هدف را بهبود می بخشد و جهش زایی ناخواسته را در برخی از مناطق off-target را تا ۵ هزار برابر کاهش می دهد. در همین حال، RGEN هایی که از این sgRNA های تغییر یافته استفاده می‌کنند فعالیت آن-تارگتی شان کاهش یافته است. تلاش در جهت اصلاح توالی sgRNA به منظور افزایش اختصاصیت sgRNA ها بدون به خطر انداختن راندمان آن-تارگتی ، نتایج مستمری ارائه نکرده است. صدها هزار سایت “seed + NGG” در ژنوم وجود دارد ، بااین‌حال <1٪ در واقع توسط dCas9 محدود شده اند ، و بیشتر تطابق ها در پروموتورها ، inhancerها و ژن ها هستند. بنابراین ، هنگامی‌که ما sgRNA را طراحی می کنیم، باید sgRNA ها را در پروموترها ، inhancer ها و ژن ها تا حد امکان انتخاب کنیم تا بازده شکاف هدف بهبود یابد. بااین‌حال ، سایتهایی که توسط سیستم CRISPR / Cas9 برش شده اند می توانند هم سایت‌های هدف و هم غیر هدف باشند و ما باید آن را مطابق با اهداف آزمایشی مختلف متعادل کنیم.

دوم ، یک استراتژی بالقوه برای به حداقل رساندن اثرات آف-تارگت کنترل غلظت کمپلکس Cas9-sgRNA با تیتر کردن مقدار Cas9 و sgRNA منتقل شده است. بااین‌حال، افزایش اختصاصیت با کاهش مقدار DNA منتقل شده همچنین منجر به کاهش شکاف آن-تارگت می‌شود. بنابراین ، باید یک تعادل بین بازده شکاف آن-تارگت و اثرات آف-تارگت در نظر گرفته شود. با این وجود ، بهینه سازی آینده در طراحی Cas9 و sgRNA ممکن است اختصاصیت Cas9 را بدون قربانی کردن بازده شکاف بهبود بخشد.

سوم ، نوکلئاز نوع وحشی Cas9 را می‌توان با آن نسخه نیکاز جهش‌یافته D10 از Cas9 و جفت شده با دو sgRNA که هرکدام فقط یک رشته را برش می‌دهد، جایگزین کرد. استراتژی nicking جفت شده باعث کاهش قابل‌توجه فعالیت آف-تارگتی حدود ۵۰-۱.۵۰۰ برابر در رده‌های سلولی شده و ناک اوت ژن را در زایگوت های موش تسهیل می‌کند بدون اینکه راندمان آن-تارگتی را کاهش دهد. این استراتژی همه‌کاره طیف گسترده‌ای از برنامه‌های ویرایش ژنوم را که نیاز به اختصاصیت بالایی دارند، ممکن می‌سازد. علاوه بر این ، تعمیر دو شکاف تولیدشده توسط شکاف دوگانه، دنباله ۵ تولید می‌کند که منجر به تشکیل ایندل های بیشتری نسبت به دنباله ۳ می‌شود. تزریق هم‌زمان جنین‌های موش با نوع Cas9 و sgRNA های وحشی باعث جهش‌های آف-تارگت و آن-تارگتی می‌شود که قابل‌انتقال به فرزندان است. در مقابل، از شکاف دوتایی می‌توان در داخل بدن استفاده کرد تا جهش مؤثر در یک یا چند ژن با حداقل جهش آف-تارگت و با حفظ بازده آن-تارگت بر روی هدف انجام دهد. همچنین یک چارچوب ایجادشده برای طراحی بهینه sgRNA های جفت شده و ابزارهای محاسباتی برای پیش‌بینی سایت‌های آف-تارگت بالقوه برای جفت‌های sgRNA وجود دارد. جفت بهینه سایت‌های Cas9 در جهت دم به دم قرار دارند که از جفت باز ۱۰- تا ۳۰+ با توالی ۵-CCNGG-3 از هم جدا می‌شوند. این روش برای ویرایش ژنوم هر ارگانیسم مدل قابل‌استفاده است و مشکلات جهش‌های آف-تارگت را به حداقل می‌رساند ، ازاین‌رو پتانسیل کاربرد بسیار خوبی در ژن‌درمانی بالینی دارد. چهارم ، برای بهبود بیشتر اختصاصیت شکاف DNA، فیوزهای کاتالیستی غیرفعال Cas9 با دامنه FokI nuclease (fCas9) تولیدشده است، که سایت‌های DNA هدف را با > 140 برابر اختصاصیت بالاتر از نوع وحشی  Cas9 و حداقل چهار برابر از شکاف جفتی حاصل از نیکاز در مکان‌هایی بسیار مشابه با سایت‌های آف-تارگت  ویرایش می‌کند. این کار پایه و اساس توصیف بیشتر و بهبود اختصاصیت Cas9 و فعالیت شکاف در شرایط in vitro و in vivo را فراهم می‌کند.

منبع

برای دانلود فیلم آموزشی طراحی gRNA اینجا کلیک کنید.

برای دانلود فیلم آموزشی ناک این ژن با کریسپر اینجا کلیک کنید.

برای دانلود بسته جامع آموزش کریسپر  اینجا کلیک کنید.

برای دیدن فیلم آموزشی ناک اوت ژن با کریسپر  اینجا کلیک کنید.

 

 

sajjad yazdanpanah
sajjad

راه آسان‌تری برای ارتباط با کاربران‌مان پیدا کرده‌ایم :) عضویت در کانال

مطالب زیر را حتما بخوانید:

  چنانچه دیدگاهی توهین آمیز باشد و متوجه اشخاص مدیر، نویسندگان و سایر کاربران باشد تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاه شما جنبه ی تبلیغاتی داشته باشد تایید نخواهد شد. چنانچه از لینک سایر وبسایت ها و یا وبسایت خود در دیدگاه استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه در دیدگاه خود از شماره تماس، ایمیل و آیدی تلگرام استفاده کرده باشید تایید نخواهد شد. چنانچه دیدگاهی بی ارتباط با موضوع آموزش مطرح شود تایید نخواهد شد.  

نظرات کاربران

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

لینک کوتاه :

عضویت در خبرنامه ویژه مشتریان بیوتیچر

با عضویت در خبرنامه ویژه بیوتیچر از آخرین جشنواره های سایت باخبر شوید!